塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术（RPA）实时荧光检测方法的建立

在 RPA 诊断方法研究中，Wang 等采用琼脂糖凝胶电泳方式，检测 RPA 扩增的犬细小病毒2 型，在 10 min 可最低检测到 10 拷贝 DNA 分子；  Abd El Wahed 等采用实时荧光的方式，检测中  东呼吸综合征冠状病毒，在 10 min 可最低检测到  10 拷贝 RNA 分子；Teoh 等建立的登革热实时  荧光 RPA 方法耗时 20 min，检出限为 10 个拷贝的RNA 分子；Rohrman 等建立的侧流层析试纸条  RPA 方法检测 HIV，在 10 min 可最低检测到 1 000个拷贝数的 DNA 分子；Crannell 等 [8] 开发的侧流  层析试纸条 RPA 方法检测贾第鞭毛虫，在 30 min  可最低检测到 10 个拷贝数的 DNA 分子。本研究  开发的 SVV 实时荧光 RPA 方法，在 10 min 内可  检测 28 个拷贝数的 DNA 分子，敏感度与上述研究结果类似，在反应时间上，将荧光定量 PCR 耗时 2 h 缩短至 10 min，在保证检测敏感度的同时提高了检测效率。  

RPA 方法开发近 10 年，除了其等温、快速扩  增的优点外，引物设计复杂、生产成本较高给本方  法的实际应用造成一定的困难。在引物设计方面，  由于单链绑定蛋白需要寡核苷酸长度在 30~35 bp  以上才能将引物整合到双链 DNA，因此 RPA 的  上下游引物长于普通 PCR 及 qPCR 引物；此外，RPA 探针长度约为 46~52 个核苷酸，也长于 qPCR  的探针，加之目前无软件辅助，RPA 引物探针设  计难度高于普通 PCR 及 qPCR。尽管如此，RPA  商业开发公司，TwistDX 公司在引物设计方面给  出了相关建议：扩增产物长度在 500 bp 以内，以  100~200 bp 为宜；5' 端 3~5 个核苷酸应当避免出现  多个 G；在 3' 端应有 GC；避免连续出现多个相同  核苷酸；GC 含量占 30%~70%；避免引物形成二  聚体和二级结构。在实际的实验中，按照上述建  议设计了 3 组探针引物。结果发现，有 2 组可用于实验，其中组合 3（148 bp）的扩增效果好于组合  1（210 bp），也印证了“片段长度 100~200 bp 为  宜”的要求。在生产成本方面，以本研究应用的实  时荧光 RPA 为例，单个样品的检测成本约 50 元人民币，高于实时荧光定量 PCR（约 20 元 / 样）。  但是，实时荧光 RPA 监控仪价格为 45 000 元左右，  远低于实时荧光定量 PCR 仪（30 万 ~50 万），且该仪器体积小，便于携带，反应耗时短，更适于 POC（床旁）及现场检测。例如，2014 年几内亚暴发埃博拉疫情时，RPA 技术被成功应用到移动实验室对埃博拉病毒的现场快速诊断中。综上，本研究设计并成功筛选出一组引物探针，建立了实时荧光 RPA 方法，用于 SVV 核酸的检测。结果显示，反应在 40 ℃ 10 min 内，可最低检测到阳性标准品的浓度为 28 拷贝 /μL，且不与 FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV 等发生交叉反应。本方法特异、敏感、重复性良好，且使用方便、耗时短，可在猪群出现水疱性临床症状的早期做出快速诊断，便于及时采取有效措施，控制疫病的传播扩散。

参考文献（略）

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