塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术（RPA）实时荧光检测方法的建立

在 pUC19-SVV 质粒模板浓度为 10-3 ng 的条件下，按照 Twist Amp exo 试剂盒说明书，在 50 μL反应体系中，在预添加 exo 酶的 PCR 反应管中加入 Rehydration Buffer 29.5 μL，ddH2O 8.2 μL，10μmol/L 上游引物（F）2.1 μL，10 μmol/L 下游引物（R）2.1 μL，10 μmol/L 探针（P）0.6 μL，DNA模板 5 μL，Mg2+ 2.5 μL；将 PCR 管放入实时荧光RPA 监测仪器 TwistaTM，设定反应温度和时间；在温度为 35、37、39、40、42 ℃下反应 15 min，进行实时荧光 RPA 反应，检测荧光强度。

1.6　荧光定量 PCR 反应

采用 Probe qPCR Mix 试剂盒，使用前期研究报道的引物探针 [5]，在 20 μL 的反应体系中，2×qPCR Mix 10 μL，上下游引物 0.8 μL，探针 0.4μL，cDNA 模板 2 μL，加水补齐至 20 μL，进行荧光定量 PCR 反应。反应条件为 95 ℃ 2 min；94 ℃15 s、60 ℃ 1 min，共 40 个循环。将 pUC19-SVV质粒标准品 10 倍倍比稀释（2.8×106~2.8×100 拷贝 /μL）进行荧光定量 PCR 检测，测定 CT 值。

1.7　特异性试验

应用 1.5 中所筛选的最优反应体系， 以FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV 的 cDNA作为模板，利用最佳反应条件进行实时荧光 RPA检测，评价该方法的特异性。

1.8　敏感性试验

应用 1.5 中所筛选的最优反应体系，并参照方法 1.6，将 pUC19-SVV 质粒标准品按 10 倍倍比稀释至 7 个浓度（2.8×106~2.8×100 拷贝 /μL），分别作为模板，以最佳反应条件进行检测，确定该方法的最小检出量。测定荧光强度超过 1 500 mV 时所需的时间，同时进行实时荧光 PCR 反应，比较两种检测方法的敏感性。

1.9　重复性试验

应用 1.5 中所筛选的最优反应体系，对 2.8×106、2.8×105、2.8×104、2.8×103、2.8×102、2.8×101、2.8×100 拷贝 /μL，共 7 个稀释梯度的 pUC19-SVV 质粒标准品做 3 批重复检测，并以 ddH2O 作为阴性对照，确定检测方法的重复效果。

1.10　统计分析

采用 SPSS 18.0 进行数据的统计分析，计量资料以“均数 ± 标准差”表示；组间计量资料的比较采用 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　引物筛选

本研究设计了 3 组引物探针组合，通过NCBI 的 BLAST，并与主要猪病病毒（FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV）序列比对分析，确定其特异性良好。在 39 ℃下，使用组合 1、2、3，对 2.8×102 拷贝 /μL 样品进行 RPA 扩增。结果显示，组合 1、3 样品相比阴性对照，随时间推移荧光强度逐渐升高（图 1-A），其中组合 3 荧光强度可达 3 000 mV 以上，高于组合 1和 2，差异极显著（P<0.0001）（图 1-B）。此外，组合 3 达到 1 500 mV 所需时间显著小于组合 1，而组合 2 荧光强度未达到 1 500 mV（图 1-C）。因此，选择组合 3 引物探针用于后续方法的研究。

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