塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术（RPA）实时荧光检测方法的建立

2.4　敏感性试验

为了确定实时荧光 RPA 方法的最小检出量，本研究分别选取不同稀释度标准品作为模板进行检测，以实时荧光 RPA 监测仪要求的荧光强度 1 500 mV作为阳性检出限，并与荧光定量 PCR 方法进行敏感度比较。结果显示，RPA 方法可在 4 min 内检测到浓度为 2.8×106 拷贝 /μL 的样品，对应的荧光定量 PCR Ct 值为 16.06±0.03，在 10 min 内，可检测最低浓度为 2.8×101 拷贝 /μL 的样品，对应的荧光定量 PCR Ct 值为 34.41±0.46（图 5），说明实时荧光 RPA 敏感度与荧光定量 PCR 方法相当，但检测所需要的时间从荧光定量 PCR 的 2 h 缩短至10 min。

图 5 SVV 实时荧光 RPA 的敏感性试验

2.5　重复性试验  

为了评价本检测方法的重复性，采用了 6 个不同稀释梯度的 pUC19-SVV 质粒标准品作为模板，进行 3 次重复试验。结果如表 2 所示，反应  10 min，各时间点荧光强度值组间变异系数范围在  0.39%~39.78%，荧光强度达 1 500 mV 所需时间变  异系数范围在 2.44%~14.95%。样品浓度越高，检  测所需时间越短，2.8×106 拷贝/μL样品在4 min内，  荧光强度值即可达到 1 500 mV。  

3　讨论  

通常认为，猪水疱性疾病（Vesicular disease，  VD）由口蹄疫病毒（FMDV，小 RNA 病毒科口疮  病毒属）、水疱性口炎病毒（VSV，弹状病毒科水  疱病毒属）、猪传染性水泡病毒（VESV，杯状病  毒科水疱疹病毒属）、猪水疱病（SVD，小 RNA  病毒科肠病毒属）4 种病毒引起。但近年来，美国、巴西、澳大利亚等国陆续发现了猪“水疱性”临床症状，而经检测，上述 4 种病毒均为阴性。随后，该病被确定为猪原发性疱疹病（Swine idiopathic  vesicular disease，SIVD）。SVV 本身并不会给生产造成严重影响。但由于动物感染该病毒后，口部、鼻腔部以及蹄冠带等部位出现疱疹，需要进行快速、准确鉴别诊断，以排除动物感染FMD的可能。目前，针对 SVV 感染的诊断方法包括病毒中和试验、间接 ELISA、竞争 ELISA 方法、PCR 方法。此外，  本实验室成功建立了快速、敏感的 TaqMan 荧光定量 PCR 诊断方法，仅需 2 h，即可通过核酸的特异  性扩增，完成鉴别诊断。

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