牛结核病污染场4种检测方法评估

摘要 ：为寻找最适合牛结核病污染场的检测方法，加快牛结核病净化，采用牛结核菌素（PPD）皮内变态反应试验（TST）、比较皮内变态反应试验（SICTT）、牛结核病 ELISA-γ- 干扰素试验（IFN-γ-ELISA）、牛结核病抗体 ELISA 试验 4 种方法，对某结核病污染牛场 300 头奶牛进行检测，并以 TST 为参考标准，对不同检测方法的检测结果进行对比分析。结果显示，这 4 种方法中，IFN-γ-ELISA 的阳性检出率最高，与 TST 相比，差异显著（P<0.05），而其他方法的阳性检出率均低于 TST。结果表明，IFN-γ-ELISA 方法的检测敏感性较高，在牛结核病污染场净化初期使用，可以尽量避免阳性牛漏检，从而加快牛结核病净化进程。

牛结核病（bovine tuberculosis，bTB）是由分枝杆菌属牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis，M. bovis）引起的一种人兽共患慢性消耗性传染性疾病，给我国养牛业带来严重危害。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。牛分枝杆菌感染宿主广泛，除可感染人外，还可感染 50 多种哺乳动物。牛结核病目前尚无有效疫苗预防，药物治疗成本太高，所以“检测 + 扑杀”是控制该疫病的主要手段。

我国目前的牛结核病检测方法主要包括，结核菌素（PPD）皮内变态反应试验（TST）、比较皮内变态反应试验（SICTT）、γ- 干扰素 ELISA试验（IFN-γ-ELISA）、抗体 ELISA 试验和胶体金检测等。TST 是我国牛结核病检测的国家标准，也是国际贸易指定方法。此方法灵敏度高，但特异性差，无法排除其他结核杆菌干扰。SICTT 与 TST相比，可排除其他杆菌干扰，减少假阳性。TST 和SICTT 检测成本低，但操作麻烦、耗时长，结果判定主观性强。IFN-γ-ELISA 试验操作简单，但成本较高。抗体ELISA是现代抗体检测的主要方法，但牛分枝杆菌抗原表位复杂，不同阶段可产生不同抗体，因而导致检测阳性率偏低。

结核病污染场内，牛分枝杆菌普遍存在，需要敏感性更高的检测方法，来尽量避免漏检，从而加快净化进程。本试验采用 TST、SICTT、IFN-γELISA 和抗体 ELISA 4 种检测方法，同时对牛结核病污染场的牛群进行检测，比较分析不同试验的检测结果，以期为我国牛结核病污染场的净化提供有效的检测方法。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　试剂与仪器　牛 PPD、禽 PPD、INF-γ 夹心 ELISA 检测试剂盒（批次 P201906-001），均购自青岛瑞尔公司；牛分枝杆菌 ELISA 抗体检测试剂盒（批号 190504），购自韩国安世佳合有限责任公司。仪器包括：剪毛剪、0.5 mL 注射器、游标卡尺、酶标仪（包含 450 nm 和 620~650 nm 滤光片）、CO2 培养箱、12 孔细胞培养板、肝素钠采血管、移液器及吸头等。

1.1.2　试验动物　某规模养殖场的300头泌乳牛。

1.2　方法

1.2.1　检测方法

1.2.1.1 TST 试验　按照国家标准《动物结核病诊断技术》（GB/T 18645—2002）的要求操作和结果判定：采用牛型 PPD，剂量为 2 000 IU，分别于注射前和注射后 72 h 测量皮肤厚度，并计算皮厚差。皮厚差≥ 4.0 mm，为阳性；2.0 mm ≤皮厚差＜ 4.0 mm，为疑似；皮厚差＜ 2.0 mm，为阴性。疑似牛于第1 次检疫 60 d 后进行复检，仍为疑似时，60 d 后再复检，如仍为疑似，则判为阳性。

1.2.1.2 SICTT 试验　采用牛 PPD 和禽 PPD，在牛颈部左侧分点皮内注射，注射点间隔 12~15 cm，72 h 后，观察注射部位的炎性反应，并量取皮皱厚，根据皮皱厚增加值判定。牛型 PPD 皮厚差减去禽型 PPD 皮厚差＞ 4 mm，判为阳性；1 mm ＜牛型PPD 皮厚差减去禽型 PPD 皮厚差≤ 4 mm，判为可疑；牛型 PPD 皮厚差≤禽型 PPD 皮厚差，判为阴性。

1.2.1.3 IFN-γ-ELISA 试验　采集 5 mL 血液肝素抗凝血液，各取 1.5 mL 加入 3 个孔中，然后分别取 100 μL 的牛型 PPD、禽型 PPD 和阴性对照磷酸盐缓冲液（PBS），加入抗凝全血中，混匀后放于含 5% CO2 的培养箱中 37 ℃培养 18 h。用移液器小心吸取培养上清，转入 1.5 mL 离心管中，即获得刺激产生的 γ- 干扰素上清。取出单抗包被板，每孔加入 50 μL 样品稀释液，然后加入 50 μL 待测样品或对照，混匀后室温作用 1 h；洗涤，每孔加入 100 μL 酶标抗体，室温作用 1 h；洗涤后每孔加入 100 μL 底物，室温避光作用 30 min 后，加入终止液，测定 OD450 nm 值。当牛型 PPD 刺激上清的OD 值 -PBS 刺激上清的 OD 值 ≥ 0.1，且牛型PPD 刺激上清 OD 值 - 禽型 PPD 刺激上清 OD值≥ 0.1，为阳性，反之为阴性。

1.2.1.4　 抗体 ELISA 试验　 按照牛分枝杆菌ELISA 抗体检测试剂盒操作步骤进行，计算 S/P值。S/P=（样品 OD450 nm 平均值 - 阴性对照 OD450 nm平均值）/（阳性对照 OD450 nm 平均值 - 阴性对照OD450 nm 平 均 值）。S/P ≥ 0.3 为 阳 性，S/P ＜ 0.3为阴性。

1.2.2　评估方法　以 TST 试验为参考标准，分别与 SICTT、IFN-γ-ELISA、抗体 ELISA 检测结果比较，计算符合率，并运用 SPSS 软件进行对比，分析敏感性差异。

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