近五年猪圆环病毒3型的研究进展

6.2 直接检测方法

目前已开发出多种基于PCR的诊断检测方法，包括基于荧光染料掺入法(SYBR Green)的实时qPCR、基于TaqMan的实时PCR和直接PCR，对组织、器官、血清、唾液、鼻拭子和环境样本的检测限均小于102拷贝/μL。微滴式数字PCR具有更高的灵敏度，可检测组织和血清样本中的PCV3，检测限为1拷贝/μL。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等等温扩增方法也已成功开发，可用于检测组织和血清样本，其灵敏度与qPCR相当。最近，利用等温扩增原理的诊断分析(添加指示剂染料甲酚红和苯酚红)实现了血清样本的可视比色检测。

由于PCV3与其他猪源性病毒混合感染的发生率相对较高，一些方法可以在存在其他病原体的情况下检测PCV3。多重qPCR检测法可从组织提取的病毒DNA中检测PCV3及其他PCV和其他病原体，其灵敏度与PCV3的单重qPCR相当。利用双标记(TaqMan)探针开发了一种四重实时PCR检测方法，可同时检测组织样本中的PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，其特异性和灵敏度与单重和传统PCR检测方法相当。此外，用于组织样本中PCV2和PCV3双重检测的高灵敏度微滴式数字PCR对PCV2和PCV3的检测限分别为2拷贝/μL和1拷贝/μL。

原位杂交已被用于证实PCV3在可疑病变组织复制。一些检测方法使用RNAScope检测平台，利用探针靶向PCV3 ORF1病毒mRNA的反向补体。其他原位杂交方法利用了PCV3特异性地高辛探针。通过原位杂交或RNAScope诊断PCV3时，提交的组织病理学标本应包括心脏、肺脏、脾脏和淋巴结的样本。PCV3抗体的开发及其在抗原直接检测中的应用一直受到限制，这可能是由于病毒难以分离。不过，也有少数研究利用免疫组织化学和免疫荧光来检测PCV3抗原。PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体与PCV2没有交叉反应，并且在扁桃体和淋巴结上能很好地检测到PCV3抗原。有报道称，在间接免疫荧光检测中使用向BALB/c小鼠腹腔注射PCV3颗粒产生的多克隆抗体，通过细胞培养可确定病毒。

6.3 间接检测方法

为了检测PCV3特异性抗体，已建立了几种ELISA检测方法。密码子优化的全长Cap蛋白已在大肠杆菌表达系统和杆状病毒表达系统中成功表达。与PCV2相似，PCV3 Cap蛋白N端33个氨基酸为核定位信号，具有较多的精氨酸，且密码子少，阻止了蛋白质在原核系统中表达。因此，大多数报道的ELISA使用的是在大肠杆菌中表达的截短Cap蛋白，其核定位信号序列被排除在外。Deng证明，间接ELISA灵敏度高，PCV3特异性IgG的最大稀释度为1∶3 200；同时，未发现与PCV1、PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV等其他猪源性病毒产生交叉反应。文献报道的ELISA大多数是为评估PCV3特异性IgG而开发的。然而，Mora-Díaz等开发了一种间接ELISA，最早可在接种后7 d检测PCV3特异性IgM。PCV3特异性抗体的血清学评估也是通过使用表达PCV3 Cap或转染重组pcDNA3.1-Cap的杆状病毒进行直接免疫荧光检测来实现的。

7 总结与未来展望

自2016年报道首例由PCV3感染引发的病例以来，该病毒已在全球范围内被广泛报道，并引发了多种临床症状。其中三种主要表现形式不断被报道,并在一定程度上得到了文献的支持：多系统炎症综合征、繁殖障碍和PDNS以及亚临床感染。在大量病例报道中，很难确定PCV3在不同临床表现中的致病作用，原因如下：一是PCV3常与多种病原体混合感染；二是病理学评估不足；三是缺乏原位检测，无法确定病变或感染组织中是否存在病毒基因组或抗原。迄今为止，与PCV3感染有关的重要证据是母猪繁殖障碍、多系统炎症和亚临床感染。

还需要在实验条件下进行进一步的研究，以确定PCV3感染作为引起临床疾病的主要病原体的真实效果。要解决这个问题，关键的一步是要开发实验挑战模型，使其能够再现与田间报道相似的疾病严重程度。目前，关于PCV3混合感染的报道有很多，因此，应将此类混合感染作为引起更严重的PCV3临床疾病的潜在因素进行评估。回顾性研究显示，PCV3已在全球流行了几十年，另一种假设是PCV3可能是PCV2和PRRSV等其他病原体感染的辅助因子，只是PCV3当时尚未被发现。因此，应开发PCV3混合感染模型，以证明PCV3与其他病原体之间的协同作用关系。

持续病毒血症已在实验中得到证实，并在田间研究中得到了确认，这表明存在再感染的可能性。然而，目前还没有阐明PCV3如何导致长期持续感染以及可能会再感染的机制。多项研究表明，PCV3可通过猪的唾液、鼻腔分泌物和粪便排毒；然而，人们对水平传播的机制仍知之甚少。PCV3通过公猪的精液和母猪的初乳进行垂直传播已得到证实，垂直传播的重要证据是在分娩前呈PCV3阳性的后备母猪所产死胎和木乃伊胎中也检测到了PCV3。此外，家猪和野猪群作为PCV3贮存宿主以及跨物种传播的可能性尚未被确定。更好地了解传播途径可以有效地控制和预防疾病。利用PCR可以在多种组织中检测到PCV3，因此，开发针对特定样本类型的更灵敏、更特异的诊断方法是应用不同诊断策略的当务之急。

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