猪细小病毒病防治技术规范

A.3.3　在上述措施的基础上，按轻度感染场净化方案。

A.4　综合措施

A.4.1　猪场要对猪舍及周边环境定期消毒。

A.4.2　禁止在猪场内饲养其它动物。

A.4.3　在猪场内实施灭鼠措施。

附录B

（规范性附录）

猪细小病毒PCR检测方法

B.1　用途

猪细小病毒（PPV）的聚合酶链反应（PCR）试验用于检测猪血清和组织中的PPV。

B.2　样品制备

B.2.1　样品采集：病死或扑杀的动物取有明显病脏器的病变部与健康部交界处组织；待检活动物，用注射器取全血5ml，4℃保存，送实验室检测。

B.2.2　样品处理：每份样品分别处理。

B.2.2.1　组织样品处理：称取待检病料0.2g置组织研磨器中剪碎并研磨，加入2ml消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清100ul，加入1.5ml灭菌离心管中，再加500ul消化液和10ul蛋白酶K，混匀后，置55℃水浴中过夜。

B.2.2.2　全血样品处理：待血凝后取血清放于离心管中，8000rpm离心5min，取血清100ul，加入500ul消化液和10ul蛋白酶K，混匀后，置55℃水浴中过夜。

B.2.2.3　阳性对照处理：阳性对照样品混匀后取100ul，加入500ul消化液和10ul蛋白酶K，混匀后，置55℃水浴中过夜。

B.2.2.4　阴性对照处理：取灭菌去离子水100ul，加入500ul消化液和10ul蛋白酶K，混匀后，置55℃水浴中过夜。

B.3　操作步骤

B.3.1　病毒模板DNA的提取

B.3.1.1　从水浴锅中取出已处理的样品，加600ul酚/氯仿/异戊醇混合液（用酚/氯仿/异戊醇混合液之前不要晃动，不要吸到酚/氯仿/异戊醇混合液上层保护液），用力颠倒10次混匀，12000rpm离心10min。

B.3.1.2　取500ul上清置于灭菌离心管中，加入500ul异丙醇，混匀，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出样品管，室温融化，13000rpm离心15 min。

B.3.1.3　弃上清，沿管壁缓缓滴入1ml70%乙醇，轻轻旋围一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，再将离心管真空抽干或50℃烘干15min（以无乙醇味为准）。

B.3.1.4　取出样品管，用30ul灭菌去离子水溶解沉淀，作为模板备用。

B.4　PCR扩增及电泳

取16ul PCR反应混合液（dNTPs、引物、10×buffer），2ul Taq DNA聚合酶（0.5u/ul），2ul模板DNA混匀，加入矿物油20ul覆盖。扩增条件为94℃3min后，94℃30s,62℃ 45s，72℃30s，循环35次，72℃延伸7min。称4g琼脂糖放于500ml锥形瓶中，加入1倍TAE电泳缓冲液200ml，于微波炉中熔解，再加10ul溴化乙锭溶液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15ul混匀3ul上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于1倍TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

B.5　结果判定

在PPV阳性对照出现313bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立，被检样品出现313bp扩增带为PPV阳性，否则为阴性。

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