猪气喘病的研究进展

    4.2  病原学诊断

    猪肺炎支原体的分离培养十分困难，因为它的苛刻培养条件和生长速度缓慢。猪肺炎支原体在猪体内主要寄居在气管、支气管和细支气管的纤毛上，菌体常呈环状及球状。在做固体培养时，生长发育很慢，尤其是初次分离到的菌株在固体培养基上长出的时间更长些，往往需要10d左右才能观察到细小的菌落，而已在实验室传代适应的菌株则存5d以上就可见到菌落。猪肺炎支原体的菌落很小，典型的  菌落为圆形，边缘整齐，灰白色，半透明，中间凸起呈乳头状，表面常有许多小的颗粒，茼落大小在100～300nm之间。在做液体培养时，可通过酚红指示剂能否使培养基颜色发生变化而判断有无菌体的生长，或将液体培养物作涂片，进行姬姆萨染色或瑞特氏染色，镜检观察。若有猪肺炎支原体感染，可见环状、电灯泡状等蔺体结构。但这两种方法比较繁杂，并且对染料质量要求较高。郑忠发采用配方简单、操作容易的复红染色法，对猪肺炎支原体培养物涂片染色，可见菌体着色鲜艳清晰，菌体形态逼真，形态有二极状、球状、车轮状、鬼脸状、藕节状等，而且菌体中的细丝都着色深而粗。

    4.3  血清学抗体检测

    血清学抗体诊断：由发病动物采集血清样本，用已知特异性抗原来检测动物血清中的特异性抗体，通过比较动物发病期间血清中抗体效价的变化或特异抗体的有无，从而判定是否存在病原体感染或者检测免疫效果。血清学检测虽然简单方便，但仍存在较多的缺点，如检测有些滞后，各霉形体之间常有交叉反应，并且难以区分抗体是来自于使用疫苗还是感染了猪肺炎霉形体。

    4.3.l  酶联免疫吸附试验：酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种将抗原、抗体反应的特异性和酶催化底物的专一性二者有机结合而形成的血清学方法，是以物理方法将抗体或抗原吸附在固相载体上，随后的一系到免疫学和酶促生化反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定试验。包括间接ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA和斑点ELISA等类型。Bereiter等(1990)对补体结合试验(CFT)、ELISA和放射免疫酶试验(RIDEA)的敏感性进行评价：在人工感染后13d，被感染猪开始咳嗽，ELISA在3周后检测到抗体。Okada等(2005)利用猪肺炎支原体P46外膜蛋白的单克隆抗体和在大肠杆菌中表达的产物建立了检测猪肺炎支原体抗体的双夹心ELISA方法。在实验感染猪肺炎支原体的猪中，该ELISA方法和CET几乎同一时间检测到猪肺炎支原体，且两种方法有很好的相关性。然而在临床检测中，两种方法没有什么相关性，CET显示出很高的非特异性。因此，他主张双夹心ELISA方法可以取代CET成为目前检测猪肺炎支原体的方法。

    4.3.2  间接血凝实验(IHA)：间接血凝实验(IHA)是以红细胞作为可溶性抗原的载体来检测抗体，可适用于多种抗原物质。其基本环节是：先使抗原物质吸附于红细胞，制备成致敏血球，然后与抗体反应，在有电解质存在条件下，抗原抗体特异性结合，红细胞被动凝集成团，称此为间接血凝实验(IHA)。间接血凝是常规病毒学免疫技术中一项应用广泛的方法，该方法的优点是敏感性高、特异性强，简便快速、稳定，且可定性和定量，价格便宜；缺点是影响红细胞凝集的因素很多，如果红细胞来源和致敏技术不过关等，血清中的杂质、细菌污染等常引起反应的失败或非特异性的凝集，而且由于不同批次或不同动物个体的红细胞具有一定的差异可造成实验结果不一致，影响对结果的分析。中国兽医药品监察所研制的检测猪肺炎支原体抗体的间接血凝(IHA)试剂盒在国内得到了广泛使用。Freeman等(1984)通过ELISA、CFT试验以及剖检来评价IHA。在检测自然感染Mhp的猪血清时发现，IHA在检测中存在着检测滴度低、结果与感染的相关性低、凝集终点判定的主观性较强以及本身固有的技术缺陷等问题，因此IHA在商品猪群的Mhp检测中实际应用前景有限。

    4.3.3  补体结合实验(CET)：原理是可溶性抗原和抗体结合后能结合补体，但一般不出现可见反应，这一现象称为溶菌反应或反应系统。如果在其中加入一定量的补体，则在反应系统作用过程中补体全部被结合，此时若加入红细胞和溶血素，便不会发生溶血反应；相反，如果溶菌系统中抗原和抗体不相对应，其中的补体就不会被利用而游离于系统中，此时加入溶血系统就会出现溶血现象。这种利用溶血系统作为指示剂来判断溶菌系统中抗原与抗体是否对应的实验，称为补体结合实验(CFT)。补体结合实验检测猪肺炎支原体麻烦、牦时，变叉反应是主要的技术壁垒(Okada et et al.，2005)。Bereiter等(1990)对CFT、ELISA和放射免疫酶实验(RIDEA)的敏感性进行评价：在人工感染后13d，被感染猪开始咳嗽，CFT在2周后检测到Mhp抗体。

    4.3.4  放射免疫酶实验(RIDEA)：Bereiter等(1990)对CFT、ELISA和KIDEA的敏感性进行评价：在人工感染后13d，被感染猪开始咳嗽，RIDEA是在5周后才开始检测到Mhp抗体。

    4.3.5  表面细胞质基因组共振实验(Surace Has-mort Resonance，SPR)：Kim(2006)利用P97牯附因子中的分子量为30 KDa的蛋白为抗原建立了检测猪肺炎支原体抗体滴度的表面细胞质基因组共振实验。该实验和传统ELISA方法同时检测了来自6个猪场的70份血清，结果显示表面细胞质基因组共振实验具有很高的特异性和敏感洼，而且两种方法有正相关性。

    5  分子生物学方法

    血清学检测虽然简单方便，但仍存在较多的缺点，如检测有些滞后，各支原体之间常有交叉反应，并且难以区分抗体是来自于使用疫苗还是感染了猪肺炎支原体。近年来，基因探针和聚合酶链反应(PCR)等分子生物学检测方法检测猪肺炎支原体具有快速、敏感、特异等优点，是将来猪气喘病检测和诊断的主要方法。

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