非洲猪瘟病毒特性及PCR检测与应对

2.3 样品处理

鼻咽拭子、环境拭子、抗凝血和血清可编号后直接取用。组织样品用无菌的镊子和剪刀剪取适当大小的组织块放入盛有PBS缓冲液和磁珠的研磨管中，用组织匀浆仪匀浆处理。经充分震荡研磨后，以10 000 r/min离心3 min后取上清液，置于1.5 mL离心管中编号备用。

2.4 DNA提取

根据说明书使用商品化核酸提取试剂盒对处理好的样品进行核酸提取，提取好的DNA应尽快进行PCR扩增（尽量不要超过2 h），若需长期保存须放置在-70～-40℃以下冰箱。

2.5 反应体系的配置

使用市面上所售的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，先拿出各试剂平衡至室温（15～25℃），融化后瞬时离心备用。每次检验需设立阴、阳性对照。设待检样品、阳性对照和阴性对照的样品总份数为n（n=待检样品数+1阴性对照+1阳性对照），将配置好的反应体系轻弹混匀，瞬时离心，分装至八连管中。然后将已提取DNA的待检样品、阴性对照和阳性对照分别加入相应的八连管中，扣紧管盖后瞬时离心，排除反应液中气泡（具体操作按各品牌商品化试剂盒说明书配置反应体系和加样）。

2.6 上机扩增

将八连管做好标记放入实时荧光PCR仪内，记录好样本摆放顺序。选择FAM通道，并按试剂说明书设置反应参数。一般反应参数设置为：第一阶段，预变性95℃ 3 min；第二阶段，95℃ 10 s，60℃ 30 s共45个循环、荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行（具体操作按各品牌商品化试剂盒说明书配置反应参数设置）。

2.7 结果判定

第一步，判断试验结果是否成立。

阳性对照需满足CT值≤35且呈现特异性扩增曲线，同时阴性对照应无CT值且无非特异性扩增曲线。满足上述条件，则试验结果成立。

第二步，进行样品结果判定。

阳性判定：被检样品CT值≤35且呈现特异性扩增曲线者，判定非洲猪瘟病毒核酸阳性。

阴性判定：被检样品无CT值或 CT值≥40且无非特异性扩增曲线者，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

疑似判定：30＜CT值＜40且呈现特异性扩增曲线者，判定为非洲猪瘟病毒核酸疑似。

复检规则：对疑似样品应重新取样复检。复检时，若CT值＜40 且呈现特异性扩增曲线，则判为阳性；否则判定为阴性。（具体CT值标准区间按各品牌商品化试剂盒说明书判定）。

3 对检测结果的判定和处理

对环境样品检测到非洲猪瘟病毒核酸的，应对栏舍、空气、办公区、衣物间等环境做好全面消杀工作，可使用过硫酸氢钾类消毒剂。消杀后应定期采集环境样品，检测非洲猪瘟病毒核酸存在情况。

在养殖场的自主监测中，若生猪样品检测呈非洲猪瘟病毒核酸阳性，但存栏生猪群体未观察到疑似临床症状，则此阳性结果属于自主监测阳性。应立即上报养殖场所在地县级以上动物疫病预防控制机构进行复检，并做好隔离观察和全面消杀工作。

对生猪样品检测到ASF病毒核酸的，并且符合下列临床症状、剖检病变标准、流行病学任何一项的，可能为可疑病例。应报养殖场所在地县级以上动物疫病预防控制机构，开展复检确认。经省级动物疫病预防控制机构实验室进行判定确诊。

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