动物源性食品中细菌的检测——李斯特氏菌

1992—1995年在法国出产的奶酪及猪肉中发现单核细胞增生李斯特氏菌，自2001年11月以来，我国质检部门多次从美国、加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等20多家肉类加工厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等30多批近千吨猪副产品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。

4 检测方法

包括病原的分离鉴定及分子生物学方法、免疫学方法等。

4.1 细菌分离鉴定

（1）样品处理 将样品保存于4℃冰箱中，若条件适宜，单核细胞增生李斯特氏菌会缓慢生长，若样品已被冷冻，则应在检测前解冻。

（2）预增菌与增菌 取25g样品放入225mL的李氏增菌肉汤（BLEB）中，混匀，进行预增菌培养。30℃培养4h后，加入放线菌酮或匹马菌素等选择性试剂，继续30℃增菌培养48h。巴氏消毒奶、奶制品、酸奶酪、冷冻水产品等含有较少的酵母菌和较少霉菌，因此不需加入抗真菌剂。但生乳、干的海产品或新鲜产品则需加入抗真菌剂。

（3）分离纯化 取增菌培养液划线接种于含七叶苷的选择分离培养基上：PALCAM琼脂平板、（改良）牛津琼脂平板或加入七叶苷和三价铁的LPM琼脂平板。以上含七叶苷的培养基根据具体要求而选用。（改良）牛津琼脂平板、PALCAM琼脂平板接菌后放置于35℃培养24～48h，含七叶苷和三价铁的LPM琼脂平板接菌后放置于30℃培养24～48h。在含七叶苷的培养基上，李斯特氏菌呈黑色，菌落周围具有黑色的环。从这些培养基上挑取5个可疑菌落划线接种到胰蛋白胨大豆胨培养基上，分离纯化单菌落。同样也可划线接种到BCM李斯特氏菌显色培养基上，单核细胞增生李斯特氏菌呈蓝色，而绵羊李斯特氏菌在食品中不常见。单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌在ALOA李斯特氏菌显色培养基上都呈蓝色且在菌落周围有酯酶环。在传统的检测方法中，利用胰蛋白胨大豆胨培养基进行菌落纯化是必须的，因为选择性培养基上分离出的菌落仍有可能包涵其他细菌。至少挑取5个菌落进行鉴定，因为在同一样品中可能含有几种李斯特氏菌，而利用BCM和ALOA李斯特氏菌显色培养基可以减少挑取的菌落数。运用商业的Confirmatory培养基，或传统的木糖/鼠李糖发酵肉汤或琼脂，可以区别单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌。胰蛋白胨大豆胨琼脂平板需在30℃培养24～48h，若不需观察运动，也可在35℃培养。对于这些认可的方法，可以用选择性琼脂分离李斯特氏菌，也可以辅助使用推荐的新的单核细胞增生李斯特氏菌Ｇ绵羊李斯特氏菌分离培养基。

（4）镜检 从30℃或低于30℃培养的平板上挑取生长良好的典型菌落，涂于洁净载玻片上，用0.85%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片于相差显微镜的油镜下观察。李斯特氏菌为短杆状，有轻微的旋转和翻滚运动。而大的杆状或快速运动的杆状细菌则不是李斯特氏菌。应用阳性的李斯特氏菌做对照。革兰氏染色试验：将培养16～24h的培养物进行染色，李斯特氏菌呈短杆状阳性菌。但若培养时间过长，染色会发生变化。

（5）生化鉴定

过氧化氢酶试验：李斯特氏菌阳性反应。

溶血试验：将7%羊血琼脂平板底面划分为20～25个小格，从胰蛋白胨大豆胨琼脂平板上挑取菌落刺种到血琼脂平板上，每格刺种一个菌落，于35℃培养24～48h，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，绵羊李斯特氏菌产生大的透明溶血环。注意：不应据此来区别李斯特氏各种菌，这仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯特氏各种菌。注意：当血琼脂平板的厚度比通常的5mm更薄时，非常容易观察到溶血环，另外这可以通过覆盖一层1～2mm血琼脂来实现。

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