做qPCR，不要钻进“唯Ct值”的牛角尖！

3、Ct值能否作为评价qPCR试剂盒的指标？

qPCR试剂的评价需要从分析敏感性（最低检测限），分析特异性（交叉反应），重复性（精密度），诊断敏感性，诊断特异性等多个指标去衡量 （诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正），诊断试剂评价系列4-最低检测限，你做对了吗？）。仅凭Ct值的高低去判断一个qPCR试剂盒的优劣太片面，不同试剂盒的Ct值不具有可比性。有些试剂盒采取先进行几个循环的预扩增，再进行正式循环的做法就是为了使Ct值看起来更低。

4、能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性？

这里指的是大部分的qPCR试剂盒的循环数为40个或45个，我们能否在不改变试剂盒的设计的前提下，仅通过将40个循环增加到45个循环，或是将临界值由38提高到40，或者由40提高到45的方式来提高试剂盒的敏感性呢？

4.1 从原理上解释

理论上，假设初始模板量为1个拷贝，酶的扩增效率100%，到达最大阈值约需要35个循环，因此业内通常认为qPCR的有效线性范围为Ct:15-35。通常酶的扩增效率无法达到100%，达到1个拷贝模板的循环数可能会达到38或更高，如下图我用qPCR和数字PCR测到了1拷贝模板对应的Ct值为37.91。当酶的效率更低或者存在抑制剂时，检测到1拷贝模板的循环数的Ct值可能会更高。

当初始模板核酸浓度≤1 copies/μL时，这时的影响因素不光是你能否检测到，还取决于你每次能取到模板的概率。因为在低浓度下，每次取到模板的概率是服从泊松分布的。不明白的可以看看（诊断试剂评价系列4-最低检测限，你做对了吗？）

（At very low copy numbers，under 20 copies per tube ，the random variation due to sampling error（poisson's error law）become significant .--《MIQE&qPCR》4ed）

4.2 qPCR循环数试验

模板浓度：将标准物质稀释为0.5，1，2，3，4，5 copies/μL，模板上样量2 μL，每个浓度10次重复。

扩增体系：使用相同的引物探针和扩增体系进行扩增，扩增体系体积为20 μL。该扩增体系的R^2=0.997,E=92.57%,斜率-3.51。

循环数：分别进行40个循环和45个循环，其他条件完全一致。

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