猪蓝耳病免疫抑制机制与疫苗再认识

4 PRRSV疫苗研发的未来

反向遗传学是一种通过分析目标基因变化所引起的表型变化来研究基因功能的技术。在病毒学领域，该技术被广泛应用于探索病毒的复制、毒力、发病机制以及疫苗开发等方面。1998年，首个PRRSV感染性克隆建成。目前，利用反向遗传学技术对病毒基因组进行改造，以获得突变或重组的后代病毒，为开发减毒活疫苗提供了新的途径。

4.1 增强I型干扰素（IFN-I）的表达

PRRSV编码多种能够抑制先天性免疫反应的病毒蛋白。因此，通过删除或突变参与免疫调节的关键病毒基因，构建候选疫苗，是一种有效的策略。已有研究表明，对nsp1β中第16～20位氨基酸进行替换的突变病毒16-5A，相较于野生型毒株，显著增强了感染细胞中的IFN-I表达。此外，含有nsp4D185N突变的重组病毒表现出较慢的复制速度，并显示出更强的IFN-I诱导能力。而具有nsp11K59A突变的病毒几乎完全失去了抑制STAT2的能力。据报道，PRRSV-A2MC2毒株具有显著的IFN诱导能力，能够诱导针对同源和异源毒株的中和抗体，这表明增强IFN-I表达是开发有效PRRSV疫苗的重要策略之一。

4.2 基因嵌合和DNA重排

目前，疫苗的主要局限在于其交叉保护能力有限。为了扩大交叉保护范围，开发一种包含多种异源PRRSV毒株中多个中和表位的嵌合疫苗具有广阔前景。早期研究显示，通过将VR2332中的ORFs3-6替换为不同毒株的相应基因，并成功拯救出嵌合病毒，能够诱导产生具有交叉保护能力的中和抗体反应。此外，研究人员还探讨了野生型与减毒活疫苗（MLV）毒株之间的嵌合体，通过将MN184的ORF5-6替代IngelvacPRRSMLV相应基因后，接种可显著减轻仔猪攻毒后的临床症状。

DNA重排（DNA-shuffling）是一种体外重组技术，用于对单个基因或同源基因库进行重组，以扩展抗原的交叉反应性。例如，利用DNA重排技术，将VR2385或FosteraPRRSMLV毒株的GP3、GP4、GP5和M基因与完全不同的亲本病毒进行重组，构建嵌合病毒。研究表明，这些嵌合病毒显著增强了针对异源PRRSV毒株的交叉中和抗体活性。此外，分析了PRRSV-2的59株病毒的完整基因组序列，并选择“保守”序列生成共享基因组，从而拯救出嵌合病毒PRRSV-CON，该病毒比野生型PRRSV提供了更广泛的异源保护。

4.3 密码子对优化

大多数氨基酸由多个同义密码子编码，然而这些密码子在不同生物体中的使用频率并非随机分布，而是表现出特定的密码子使用偏好（CodonUsageBias，CUB）。CUB能够显著影响蛋白质合成效率。鉴于病毒复制依赖于宿主细胞机制，病毒基因组的密码子偏好通常与其宿主相适应。研究表明，密码子对去优化是制备减毒疫苗株的有效策略之一。例如，已成功构建了含有非偏好密码子对的减毒流感病毒和脊髓灰质炎病毒。研究人员利用特定计算机程序对GP5基因序列中的密码子对进行去优化，并成功拯救出相应的病毒。该病毒在体外的复制能力显著降低，接种猪只在攻毒后，病毒血症水平和肺部病变发生率均减少。此外，对nsp9中的同义密码子进行去优化后，拯救出的病毒在猪宿主体内的复制能力显著下降，且接种后未见明显临床症状。这种重组病毒能有效保护猪免受同源及异源PRRSV的攻击，所有接种重组病毒的猪在病毒攻毒后均存活，未出现明显临床症状或病理损伤。密码子对去优化作为疫苗开发策略，在安全性方面具有显著优势。通过引入大量核苷酸突变，即使发生恢复突变，也难以恢复成原始毒株。

4.4 细胞因子佐剂

细胞因子在诱导免疫反应中发挥着关键作用，因此常被用作疫苗的佐剂以增强其免疫原性。为了进一步强化免疫反应，可以将细胞因子的表达基因插入到减毒的PRRSV感染性克隆中，从而构建重组病毒。例如，成功拯救了表达猪IL-4或猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的重组PRRSV。免疫接种后，这些重组病毒在面对PRRSV攻毒时，显著增加了猪体内CD4+CD8+双阳性T细胞的比例；其中，表达GM-CSF的重组病毒还能够诱导更高水平的IFN-γ产生。此外，利用细胞因子作为增强细胞介导免疫反应的佐剂具有潜在价值，但仍需进一步探索更为有效的细胞因子组合及其应用策略。

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