牛奶中青霉素残留检测方法

仪器和设备

酶标仪（配备450nm滤光片）

天平  感量0.01g

分析天平 感量0.00001g

漩涡混合仪

振荡器

组织匀浆机

冷冻离心机

氮吹仪

离心管  20mL

微量移液器  单道20mL，50mL，100mL，1000mL；多道50～250mL  

测定步骤

试料的制备

试料的制备包括：

—— 取混匀后的供试样品,作为供试试料。

—— 取混匀后的空白样品,作为空白试料。

—— 取混匀后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。

提取和净化

精密量取1mL试料于离心管中，精密加入4mL0.1moL/LPB缓冲液(pH=7.2)，充分混合后加入5mL正己烷振荡提取10min，于8000r/min15℃离心10min,取出下层液体50mL用于分析。

样品测定程序（20℃～26℃条件下操作）

4.4.3.1  使用前将试剂盒置于室温（20℃～26℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2℃～8℃。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。

4.4.3.2  加入50 mL标准溶液或试样溶液到微孔底部，每孔再加入50mL青霉素抗体溶液，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，37℃环境中反应30min。

4.4.3.3  倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250mL洗涤液，10s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。

4.4.3.4  加入100mL酶标记物到微孔底部，用盖板膜封板，37℃环境中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。

4.4.3.5  加入50mL底物溶液A和50mL底物溶液B到微孔中，轻轻振荡混匀37℃环境避光显色15min。

4.4.3.6  加入50mL终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。

结果计算和表述

百分吸光度值=      ×100%  ………………………………………………………  1.1    

式中:

B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；

B₀—为零浓度标准溶液的平均吸光度值。

以X轴为标准溶液中青霉素浓度(mg/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（mg/L）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程，计算未知样品中青霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中青霉素的浓度。

注：检测结果小于2.0μg/L时，可判为未检出，大于2.0μg/ L时，判为可疑，需用确证法确认。

检测方法灵敏度、准确度、精密度

灵敏度

本方法在牛奶中的最低检出限为2.0µg/L。

准确度

本方法在牛奶中2.0µg/L～6.0µg/L添加浓度的回收率为60.0%～120.0%。

精密度

本方法的批内变异系数CV≤14.0%；批间变异系数CV≤15.0%。

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