仪器和设备 酶标仪（配备450nm滤光片） 天平 感量0.01g 分析天平 感量0.00001g 漩涡混合仪 振荡器 组织匀浆机 冷冻离心机 氮吹仪 离心管 20mL 微量移液器 单道20mL，50mL，100mL，1000mL；多道50～250mL 测定步骤 试料的制备 试料的制备包括： —— 取混匀后的供试样品,作为供试试料。 —— 取混匀后的空白样品,作为空白试料。 —— 取混匀后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。 提取和净化 精密量取1mL试料于离心管中，精密加入4mL0.1moL/LPB缓冲液(pH=7.2)，充分混合后加入5mL正己烷振荡提取10min，于8000r/min15℃离心10min,取出下层液体50mL用于分析。 样品测定程序（20℃～26℃条件下操作） 4.4.3.1 使用前将试剂盒置于室温（20℃～26℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2℃～8℃。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。 4.4.3.2 加入50 mL标准溶液或试样溶液到微孔底部，每孔再加入50mL青霉素抗体溶液，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，37℃环境中反应30min。 4.4.3.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250mL洗涤液，10s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。 4.4.3.4 加入100mL酶标记物到微孔底部，用盖板膜封板，37℃环境中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。 4.4.3.5 加入50mL底物溶液A和50mL底物溶液B到微孔中，轻轻振荡混匀37℃环境避光显色15min。 4.4.3.6 加入50mL终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。 结果计算和表述 所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示： 百分吸光度值= ×100% ……………………………………………………… 1.1 式中: B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值； B0—为零浓度标准溶液的平均吸光度值。 以X轴为标准溶液中青霉素浓度(mg/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（mg/L）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程，计算未知样品中青霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中青霉素的浓度。 注：检测结果小于2.0μg/L时，可判为未检出，大于2.0μg/ L时，判为可疑，需用确证法确认。 检测方法灵敏度、准确度、精密度 灵敏度 本方法在牛奶中的最低检出限为2.0µg/L。 准确度 本方法在牛奶中2.0µg/L～6.0µg/L添加浓度的回收率为60.0%～120.0%。 精密度 本方法的批内变异系数CV≤14.0%；批间变异系数CV≤15.0%。
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