基于全面质量管理提升实验室非洲猪瘟病毒检测能力

摘要：非洲猪瘟已经成为我国养猪业防控的头号疫病，而荧光PCR方法是广泛用于各实验室非洲猪瘟病毒检测的首选方法。为提高相关实验室非洲猪瘟病毒荧光PCR检测的准确性，针对非洲猪瘟病毒荧光PCR检测过程可能存在的“假阳性”和“假阴性”现象，从全面质量管理理论的“人、机、料、法、环”等具体方面，详细阐述了这些现象产生的原因及改进措施或解决方案，从而为我国各级兽医实验室、屠宰场、养殖场、第三方检测机构等开展非洲猪瘟病毒检测提供参考，同时也为其他疫病病原的荧光PCR检测提供借鉴。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种家猪和野猪烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASF 病程短，发病率和死亡率高，病死率可达 100%，给养猪业带来严重威胁。ASFV 在外界环境中存活能力较强，传播途径多样，既可通过猪与猪、猪与蜱的直接接触传播，也可通过食物、粪便、运输工具、人员等间接传播。猪感染 ASFV 后很难产生有效的中和保护抗体，且目前尚无有效的疫苗可用，因此 ASFV 核酸检测是防控 ASF 的主要措施之一。我国自 2018 年首次暴发 ASF 以来，养猪业损失重大，各地纷纷加强了 ASFV 核酸检测。一些检测方法如荧光 PCR、LAMP、试纸条等也开始用于 ASFV 检测。其中，针对 ASFV 核酸检测的荧光 PCR 方法，以其敏感、特异、快速、稳定的优点，在我国各级兽医检测实验室、养猪场、屠宰场、第三方检测机构等广泛应用。与此同时，随着 ASFV 检测强度增大和频率增多，很多检测实验室陆续出现荧光 PCR检测结果“假阳性、假阴性”问题，严重干扰了正常的检测工作。这些问题或多或少与检测实验室的质量管理有关。本文根据全面质量管理理论和《ISO/IEC17025 校准和检测实验室管理体系》，结合部分 ASF 检测实验室的实际情况，总结了目前 ASFV 荧光 PCR 检测过程中遇到的问题，从全面质量管理理论的“人、机、料、法、环”等环节，进行了详细阐述和剖析，并逐项提出了相应的改进措施或解决方案，以期为相关从业部门开展 ASFV检测提供参考。

1 人员

在影响 ASFV 检测结果的所有因素中，人是最关键的，是起到决定性作用的因素。ASFV 检测的任何环节，不管是样品采集、运输、灭活、预处理、核酸提取，还是荧光 PCR 扩增体系配制、反应程序设置、结果判定和分析等，都离不开检测人员的参与。检测人员的基本素质和操作技能直接决定了检测质量。检测人员在任何环节出现失误，都有可能导致检测失败，因此对检测人员提出了较高的要求：

一是在思想上要树立“规范操作、防止污染”的理念，深刻认识“操作不规范，核酸就会无处不在”的现象，从而在操作上严格要求自己；

二是从制度上要加强采样和检测人员管理，设立 ASFV 核酸检测岗位，制定检测规程，提出检测技能操作要求，建立岗位和人员考核制度，定期对相关人员开展考核，考核合格者方可上岗；

三是要对采样和检测人员定期开展 ASF 检测培训，强化其试验操作技能，提升其理论水平，规范其操作流程，使其熟悉法律法规，能够解决工作中经常遇到的问题；四是要在不同检测人员甚至实验室之间定期开展检测能力比对，通过不同人员和实验室的检测比对寻找差距，从而提高整体检测水平。

2 仪器设备

ASFV 荧光 PCR 检测涉及的仪器有荧光 PCR仪、组织匀浆机、离心机、移液器、生物安全柜等。在处理样品和加样过程中，这些仪器都存在一定的污染或交叉感染风险。这些仪器设备在使用过程中可能存在的主要问题有：

一是荧光 PCR 仪的精确性问题。荧光 PCR 仪是检测的最关键仪器，其精度高、仪器元件精细，但出现问题的类型复杂多样，既有硬件问题，也有软件问题。硬件问题有：荧光 PCR 仪滤镜污渍导致光路强度下降、灯源效能降低，加热槽个别孔污物过多导致受热不均或出现边缘效应等；软件问题有：吸光值不高、扩增曲线不典型、出现非特异性扩增、样品全部为阴性等。为确保 PCR 仪检测结果准确可靠，必须定期对荧光 PCR 进行校准；检测实验室可以根据发布的《聚合酶链反应分析仪校准规范》（JJF1527—2015），对实验室的实时荧光 PCR 仪温度和光学系统定期进行校准，或者采用商品化的 PCR 仪校准品试剂进行校准，以保障荧光 PCR 硬件正常运行。解决荧光 PCR 软件方面的问题主要注意以下几点：循环段与恒温段起始温度位置是否正确，各个阶段的温度与时间是否正确，荧光信号设置的采集点是否合适，所采集的荧光信号是否与说明书一致，实时荧光 PCR 反应结束后是否设置了无效基线范围。这些因素必须逐项检查，一一排除。

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