副猪嗜血杆菌与猪链球菌混合感染案例分析（图）

表1 猪链球菌及副猪嗜血杆菌引物设计

2.2.1.2 PCR模板

病料DNA/RNA提取：剪取病变明显的部位，放入装有磁珠的EP管中，加入500 μL的PBS，组织破碎仪将组织磨碎，之后按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书进行基因组提取：用接种环勾取单个纯化培养后的菌落，加入到500 μL的液体培养基中，37 ℃摇菌过夜，以此作为PCR反应的模板。同时做阳性对照及阴性对照。

2.2.1.3 PCR反应体系及反应条件

猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR反应体系：病毒RNA的反转（10 μL）：RNA模板2 μL ，5×Buffer 2 μL，反转引物（GP5-R1） 0.5 μL，dNTP 0.5 μL，RNase inhibitor 0.25 μL，RTass M-MLV 0.5 μL，ddH2O 4.25 μL；一次PCR体系（20 μL）：反转cDNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物(GP5-F1/R1)各1 μL，ddH2O 6 μL；二次PCR反应体系（20 μL）：第一次PCR产物 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（GP5-F2/R2）各1 μL，ddH2O 7 μL。

猪繁殖与呼吸综合征病毒套式PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；一次PCR 94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，30个循环；二次PCR 94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

副猪嗜血杆菌套式PCR反应体系：一次PCR体系（20 μL）：菌体（病料）DNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（HPS-Outer-F/R）各1 μL，ddH2O 6 μL；二次PCR反应体系（20 μL）：第一次PCR产物 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（HPS-Inner-F/R）各1 μL，ddH20 7 μL。

副猪嗜血杆菌PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；一次PCR 94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；二次PCR 94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

猪链球菌PCR反应体系（20 μL）：菌体（病料）DNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（SS-F/R）各1 μL，ddH2O 6 μL。

猪链球菌PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

经5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。

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